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本试剂盒可从新鲜全血中高效提取总RNA，可处理不同物种以及多种抗凝剂全血样品。吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，高效、专一吸附RNA，可最大限度去除杂质蛋白。提取的RNA可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、高通量测序、Northern Blot、Dot Blot、Poly A筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游实验。

• 适用于不同物种新鲜全血，操作简单。
  
• 配有CS过滤柱，可有效去除杂质。
  
• 精心配置的缓冲液，保证RNA提取高效稳定，适用于多种下游实验。
  
• 操作安全可靠，无需酚/氯仿抽提。

试剂盒组成：

组分	规格
10×红细胞裂解液H	60mL
裂解液RLH	30mL
去蛋白液RW1H	24mL
漂洗液RW	12mL
RNase-Free ddH2O（瓶装)	15mL
RNase-Free吸附柱CR4（含2mL收集管)	50套
RNase-Free过滤柱CS（含2mL收集管)	50套
DNase I	1500U
缓冲液RDD	4mL
RNase-Free ddH2O（管装)	1mL
RNase-Free离心管（1.5mL)	50个

保存条件：室温（15～25℃）保存，DNaseI，缓冲液RDD，2～8℃保存，加入β-巯基乙醇的裂解液RLH 4℃可放置一个月


β-巯基乙醇、无水乙醇

预防RNase污染

• 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
  
• 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
  
• RNA在裂解液RLH中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
  
• 配制溶液应使用RNase-free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V)，混匀后放置过夜，高压灭菌。)

• 操作前在RLH中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mL RLH中加入10μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLH 4℃可放置一个月，裂解液RLH在储存时可能会形成沉淀，如果有沉淀出现，请加热溶解后使用。
  
• 第一次使用前应在漂洗液RW与去蛋白液RW1H中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
  
• 人类的血液或体液可能有潜在的感染性，所以如果对人类的全血进行处理，请注意做好防护措施。
  
• 本试剂盒最多能处理1.5mL健康的人类全血（健康人的全血中白细胞含量为：最多4000～7000个白细胞/μl血液)，如果血液中白细胞的含量较高，可按比例减少血液的用量，本试剂盒最多可处理的白细胞数量为：1×10⁷。
  
• 在白细胞裂解后，该说明书中的所有步骤需在室温（15～25℃)进行，操作速度越快越好。
  
• 细胞溶解物（在裂解液RLH中)可以存放在-70℃，待使用时，将其置于37℃孵育10min，以保证所有的盐都溶解，然后进行操作步骤第7步。
  
• 本试剂盒不适用于冻存的全血。

DNase I储存液的配制：
将DNase I干粉（1500U)溶解在550μL RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月)。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃ （可保存6周)，不要再次冻存。


使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

• 红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液H （例如待处理的血液样品体积为200μL，则取140μL 10×红细胞裂解液H)，用RNase-Free ddH2O稀释至1×红细胞裂解液H。
  
• 向1体积人类全血中加5倍体积1×红细胞裂解液H （需自备合适的干净管子)。
  注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液H的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6步中的1×红细胞裂解液H的使用体积也要进行相应调整。
  
• 在冰上孵育10～15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。
  注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20min。
  
• 4℃ 2100rpm （~400×g)离心10min，将上清完全去除。
  注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。
  
• 向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液H （加入1×红细胞裂解液H的体积是第1步中全血用量的2倍)，重悬细胞。
  
• 4℃，2100rpm （~400×g)离心10min，将上清完全去除。
  注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的RNA与膜的结合，导致最后RNA产率降低。
  
• 向白细胞沉淀中加入裂解液RLH （使用前请加入β-巯基乙醇)，具体加量按照下表进行，涡旋或使用移液器混匀。
  注：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RLH的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失。
  

  裂解液RLH	健康人类全血	白细胞数量
  350μL	≤0.5mL	≤2×106
  600μL	0.5～1.5mL	2×106～1×107

  
  
• 将溶液转移至过滤柱CS中（过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm （~13400×g)离心2min，弃去过滤柱CS，收集滤液。
  注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750μL以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。
  
• 向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为350μL或600μL)，混匀（此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中（吸附柱CR4放入收集管中)，12000rpm（~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
  注意：配制70%乙醇时请使用RNase-Free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70%乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR4时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。
  
• 如果不进行DNase I消化，可以直接向吸附柱CR4中加入700μL去蛋白液RW1H （使用前请先检查是否已加入乙醇)，12000rpm （~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，直接进行步骤14。
  DNase I消化：向吸附柱CR4中加入350μL去蛋白液RW1H，12000rpm （~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
  
• DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。
  
• 向吸附柱CR4中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。
  
• 向吸附柱CR4中加入350μL去蛋白液RW1H，12000rpm （~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
  
• 向吸附柱CR4中加入500μL漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm （~13400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
  
• 重复步骤14。
  
• 12000rpm （~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR4置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
  注意：离心后将吸附柱CR4在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的反转录，荧光定量等实验。
  
• 将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30～50μL RNase-Free ddH2O室温放置2min，12000rpm （~13400×g)离心2min，得到RNA溶液。
  注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

图1．加入不同抗凝剂的新鲜大鼠血100μL，洗脱体积50μL，RNA上样4～6μL。


图2．新鲜小鼠血液100μL，洗脱体积50μL，RNA上样4～6μL。
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